三級生物安全柜是為4級實驗室生物安全等級而設計的，是目前世界上最高安全防護等級的安全柜。柜體完全氣密，100%全排放式，所有氣體不參與循環，工作人員通過連接在柜體的手套進行操作，俗稱手套箱(Golve box)，試驗品通過雙門的傳遞箱進出安全柜以確保不受污染，適用于高風險的生物試驗。

　　在允許循環化學氣體的操作條件下，可以使用外接排放管道蓋(Exhaust Collar)的A2型二級生物安全柜。排放管道蓋與一般硬管不同的是有可吸入空氣的進氣孔;排放管道蓋與外排管道連接，然后接到一個外排風機。排放管道蓋上的進氣孔對于A2型二級生物安全柜通過內置風機保持進氣流和下沉氣流的平衡至關重要。如果使用密封的外接風管，進氣流將會過強可能導致安全柜對產品的保護實效;而排放管道蓋上的進氣孔可以從室內吸入空氣，而不會影響安全柜內的氣流平衡。此條件只適用于微量有毒化學物質。

　　如果不允許循環化學氣體，則必須使用裝備硬管的B2型二級生物安全柜。由于B型安全柜不是獨立平衡系統，它的內置風機只能制造下沉氣流，安全柜依賴外排風機制造進氣流。這種型號的安全柜在安裝和維護時會較為復雜，因為外排風機必須與內置風機保持平衡，否則將導致對操作人員或產品的安全性能的失效。

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